มหากาพย์ประวัติศาสตร์ CRISPR/Cas
...จากงานวิจัย “ขึ้นหิ้ง” สู่เทคโนโลยีเปลี่ยนโลก
ตอนที่ 1: ของขวัญจากนาเกลือสีเลือด
Haloferax mediterranei เป็นจุลชีพดึกดำบรรพ์ (archea) สีแดงเข้มที่ชื่นชอบความเค็ม เมื่ออยู่รวมกันเยอะๆในนาเกลือเปลี่ยนภูมิทัศน์นาเกลือโล่งๆ ให้เป็นบ่อน้ำสีเลือด
Haloferax mediterranei
นาเกลือที่มีจุลินทรีย์กลุ่ม archea สีแดงสด
ช่วงปี 1989 ... เกือบสามสิบปีที่แล้ว “ฮีโร่” ของเราคนแรกชื่อว่า Francisco J. M. Mojica (หน้าตาปัจจุบันเหมือนในรูปข้างล่าง) กำลังเป็นนักศึกษา ป.เอก อยู่ที่มหาวิทยาลัย Alicante ประเทศสเปนซึ่งก็อยู่ใกล้ๆกับนาเกลือสีแดงที่ Haloferax mediterranei ถูกค้นพบก่อนหน้านี้
โครงงานวิจัยของ Mojica เดิมทีไม่เกี่ยวอะไรกับ CRISPR แม้แต่น้อย แต่เป็นเรื่องเกี่ยวกับการศึกษากลไกการ “ลอยตัว” ของ H. mediterranei R4 โดยแบคทีเรียชนิดนี้สามารถผลิตถุงแก๊ส (gas vesicle) ขนาดจิ๋วขึ้นมาในเซลล์เพื่อช่วยปรับระดับการลอยตัวเมื่อระดับความเข้มข้นของเกลือในน้ำทะเลเปลี่ยนไป Mojica อยากศึกษาว่ายีนอะไรที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการนี้และยีนเหล่านั้นตอบสนองต่อความเข้มข้นของเกลือได้อย่างไร
ระหว่างที่ทำงานวิจัยนี้อยู่ Mojica ก็เจอความซวย (รึเปล่า?) ครั้งแรก คือมีทีมวิจัยอีกทีมนึงดันศึกษาหัวข้อเดียวกันนี้สำเร็จ ได้ตีพิมพ์ตัดหน้าไป (ภาษาแสลงของนักวิจัยเค้าเรียกว่าโดน “scoop”) Mojica ก็เลยต้องหันเหเป็นศึกษายีนอื่นดีเอ็นเอส่วนอื่นอะไรก็ได้ของ H. mediterranei R4 ที่เกี่ยวกับการตอบสนองต่อเกลือและยังไม่มีคนศึกษา
Mojica เลือกศึกษาชิ้นส่วนดีเอ็นเอแปลกๆชิ้นนึงบนจีโนมของ H. mediterranei ที่ดูเหมือนว่าคุณสมบัติทางเคมีจะเปลี่ยนไปที่ความเข้มข้นเกลือต่างๆกัน Mojica ลองเอาดีเอ็นเอชิ้นนี้มาทำการอ่านลำดับเบส (sequencing) ในปี 1992 ...อย่าลืมว่าสมัยเกือบสามสิบปีก่อนโน้นการทำ sequencing ไม่ได้สะดวกเหมือนปัจจุบันที่มีบริษัทรับจ้างทำมากมาย เราแค่ส่งตัวอย่างดีเอ็นเอไปเดี๋ยวทางโน้นก็จัดการที่เหลือให้หมดแล้วส่งไฟล์ลำดับเบสที่อ่านได้มาให้ สมัยก่อนโน้นนักวิจัยอย่าง Mojica ต้องทำแล็บวิเคราะห์อ่านลำดับเบสเองทั้งหมด (Sanger sequencing บน polyacrylamide เจล) การทำ sequencing ครั้งนั้นถือว่าเป็นครั้งแรกๆที่มีการsequenceดีเอ็นเอที่ของมหาลัย Alicante ด้วยซ้ำไป
ด้วยความช่างสังเกต Mojica ก็เจอ pattern ลำดับเบสแปลกๆบนดีเอ็นเอส่วนนี้ กล่าวคือมีชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดประมาณ 30 เบสซ้ำๆกัน (repeat)หลายชิ้น(ในรูปข้างล่างแทนสัญลักษณ์ด้วยสี่เหลี่ยมขนมเปียกปูนสีเทาๆ...ของจริงมีซ้ำๆกันอย่างงี้ถึง14ชิ้น) ระหว่างชิ้นมี “ช่องว่าง” (spacer ... แทนสัญลักษณ์เป็นสี่เหลี่ยมจัตุรัสสีๆ) ขนาดระยะห่างเท่าๆกัน ลำดับเบสของส่วน spacer นี้ดูจะเป็นลำดับเบสอะไรไม่รู้มั่วๆไม่เกี่ยวกับส่วน repeat สมัยโน้น Mojica เรียกชิ้นดีเอ็นเอแปลกนี้ว่า “TREPs” (ย่อมาจาก Tendem REPeats)
ตัวอย่างลำดับเบสซ้ำที่พบใน CRISPR
ปี 1995 Mojica ย้ายไปอยู่ Oxford เพื่อทำวิจัยหลังปริญญาเอกเกี่ยวกับการควบคุมการแสดงออกของยีนใน E.coli แต่ Mojica ก็ยังคงฝังใจเรื่อง TREPs ที่ทำค้างไว้ พอจบงานที่ Oxford ลุง Mojica ก็ตั้งใจกลับมาตั้งแล็บที่ Alicante เพื่อทำวิจัยเรื่องความสำคัญและกลไกการทำงานของ TREPs โดยเฉพาะ ด้วยข้อมูลที่มีอยู่ตอนนั้น Mojica รู้แล้วว่า TREPs ไม่มี Open Reading Frame (ORF) กล่าวคือมันไม่สามารถจะถูก translate ออกมาเป็นโปรตีนได้ แต่ว่ามีการ transcribe ออกมาเป็น RNA อยู่บ้าง อีกอย่างที่สมัยนั้นรู้กันคือโครงสร้างที่เป็นดีเอ็นเอลำดับเบสซ้ำๆพบได้ใน centromere หรือโครงสร้างที่คล้ายๆกันในแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับการแบ่งแยกโครโมโซมไปให้เซลลลูกสองเซลล์เท่าๆกัน (replicon partitioning) โดยลำดับเบสซ้ำๆพวกนี้จะเป็นที่จับของโปรตีนต่างๆที่ทำหน้าที่ในการแยกโครโมโซมจากกัน ดังนั้น Mojica ก็เลยตั้งสมมติฐาน (แบบผิดๆ) ว่า TREPs ต้องเกี่ยวข้องกับการแบ่งโครโมโซมก่อนการแบ่งเซลล์แน่ๆเลยจริงๆ Mojica ไม่ใช่คนแรกที่เจอ pattern แปลกๆอย่างนี้ในแบคทีเรีย ก่อนหน้านี้ก็เคยมีคนเจออะไรคล้ายๆกันนี้ในแบคทีเรียทั้งแกรมลบ เช่น E.coli และแกรมบวกเช่น พวกMycobacterium อย่างไรก็ตาม Mojica เป็นคนแรกที่เจอ pattern แบบนี้ในแบคทีเรียกลุ่ม Archea แต่ที่สำคัญกว่านั้นคือ Mojica น่าจะเป็นคนแรกที่ “สนใจ” ศึกษา pattern แปลกๆนี้อย่างจริงจัง Mojica เคยให้สัมภาษณ์ครั้งนึงว่าสมัยโน้นเอาเรื่องนี้ไปเล่าไปพรีเซนท์ที่ไหน คนฟังก็มีแต่ยักไหล่ มองบน บอกว่า “แล้วไง?” การมี patternลำดับเบสซ้ำๆในจีโนมเป็นเรื่องปกติอยู่แล้วในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด ..คนอื่นเค้าเจอกันมาหลายปีแล้ว แต่มันเอาไว้ทำอะไรไม่รู้ ช่างเหอะ
Mojica เล่าให้ฟังว่าช่วงตั้งแล็บทีแรกชีวิตบัดซบมากเพราะว่าขอทุนที่ไหนก็ไม่มีใครให้ ไม่มีคนสนใจ pattern ซ้ำในจีโนมพวกนี้ว่ามันสำคัญยังไง ศึกษาไปแล้วได้อะไร ฯลฯ นอกจากเงินวิจัยจะไม่ค่อยมีแล้ว สมมติฐานที่ตั้งไว้ผิดก็ยิ่งทำให้หลงทางไปกันใหญ่ ทำการทดลองนั่นนี่จะพิสูจน์ว่า TREPs ช่วยแยกโครโมโซมก็ไม่เจออะไรเป็นชิ้นเป็นอัน
ในช่วงเวลาเดียวกันนั้นเทคโนโลยีการ sequencing ก็ดีขึ้นเรื่อยๆ จีโนมแบคทีเรียได้รับการ sequence เสร็จสมบูรณ์ครั้งแรกในปี 1995 ถึงปี 2000 ลำดับเบสแปลกๆอย่าง TREPs เองก็ถูกค้นพบในแบคทีเรียและ archea อีกอย่างน้อย 12 species ความแพร่หลายของ TREPs ในอาณาจักรแบคทีเรียและ archeaทีให้นักวิจัยท่านอื่นๆเริ่มสงสัยมากขึ้นมา TREPs น่าจะมีหน้าที่สำคัญอะไรซักอย่างในจุลินทรีย์พวกนี้ ต่างคนต่างศึกษา เรียกไอ้เจ้าลำดับเบสซ้ำๆนี้ต่างกันไป ในที่สุดช่วงประมาณปี 2002 ทีมวิจัยที่ศึกษาเรื่องนี้ซึ่งรวมไปถึง Mojica ด้วยก็ตกลงจะเรียกเจ้าสิ่งนี้ว่า CRISPR ย่อมาจาก Clustered Regulary Interspaced Short Palindromic Repeat (ที่มีคำว่า Palindromic อยู่เป็นเพราะว่าลำดับเบสส่วนที่ซ้ำๆกันนั้นเป็นลักษณะเป็น Palindrome คืออ่านจากซ้ายไปขวาหรือขวาไปซ้ายได้เหมือนกัน)
ตัวอย่างลำดับเบสซ้ำๆที่พบใน CRISPR
ช่วงปี 2002 อีกทีมวิจัยจากเนเธอร์แลนด์ค้นพบว่ามียีนสี่ยีนที่มักจะพบอยู่ใกล้ๆ CRISPR ทีมวิจัยตั้งชื่อมันว่า CRISPR associated (Cas) gene ที่น่าสนใจคือ Cas gene จะพบวได้เฉพาะในจีโนมที่มี CRISPR เท่านั้น และจากการศึกษาเปรียบเทียบลำดับอะมิโนของ Cas protein (ที่ผลิตจาก Cas gene) กับโปรตีนอื่นๆที่ตอนนั้นเรารู้จักก็พอจะเดาได้ว่า Cas protein น่าจะสามารถจับกับกรดนิวคลีอิกได้ ดังนั้นก็เป็นคาดกันว่า Cas protein น่าจะต้องทำงานอะไรซักอย่างร่วมกับ RNA ที่ transcribe มาจาก CRISPR
ด้วยข้อมูลจีโนมที่เยอะขึ้นเรื่อย ทีมวิจัยของ Mojica ก็มุ่งมั่นศึกษาเปรียบเทียบลำดับเบสของ CRISPR จากจีโนมต่างๆอย่างต่อเนื่อง ช่วยแรกของการศึกษา CRISPR นักวิจัยเน้นไปศึกษาส่วน repeat เป็นหลักเพราะเห็นเป็น patternซ้ำๆน่าจะมีอะไรสำคัญ ขณะที่ส่วน spacer ค่อนข้างจะถูกละเลยเพราะดูจะเป็นลำดับเบสอะไรไม่รู้มั่วๆ (ขนาดชื่อเรียก “spacer” หรือ “ที่คั่น” ยังเป็นการบอกกลายๆว่ามันไม่น่าจะเอาไว้ทำอะไรหรอก คงแค่ไว้กั้นส่วน repeatเฉยๆมั้ง) ต่อมาโดยเฉพาะหลังปี 2000 ทีมของ Mojica เริ่มตั้งคำถามว่าแล้วตกลง spacer มันมาจากไหนกันแน่ วันหนึ่งทีมของ Mojica ลองเอาลำดับเบสส่วน spacer มาเทียบกับลำดับเบสในฐานข้อมูลจีโนมสาธารณะดู ก็แจ๊คพ็อตเจอว่า spacer ดันไปมีลำดับเบสตรงกับลำดับเบสของจีโนมไวรัสหรือของ conjugative plasmid (ชิ้นดีเอ็นเอที่สามารถ “ระบาด” โดยการก็อบปี้และส่งถ่ายตัวเองระหว่างแบคทีเรียได้) ทั้งไวรัสและ conjugative plasmid มีลักษณะร่วมกันคือพวกมันต่างเป็น “ปรสิต” ที่ชอบบุกเข้ามาในเซลล์แบคทีเรียโดยไม่ได้รับอนุญาติเพื่อใช้ทรัพยากรในเซลล์ก็อบปีตัวเองออกมาเยอะๆ ดังนั้นคำถามต่อมาคือ “แล้วแบคทีเรีย/archea เก็บชิ้นส่วนดีเอ็นเอของปรสิตพวกนี้ไว้เพื่ออะไร??”
Mojica คอนเฟิร์มเรื่องที่มาที่ไปของ spacer ดีเอ็นเอโดยการศึกษา CRISPR ของจุลินทรีย์ตัวอย่างสี่ชนิดคือ E.coli (ตัวแทนแบคทีเรียแกรมลบ), Streptococcus pyogenes (ตัวแทนแบคทีเรียแกรมบวก), Sulfolobus (ตัวแทน archea กลุ่ม crenarchea) และ Methanothermbacter thermoautotrophicum (ตัวแทน archea กลุ่ม euryarchea) ทีมของ Mojica พบว่า spacer ของตัวแทนจุลินทรีย์พวกนี้ต่างก็มาจากปรสิตพวกไวรัสหรือ conjugative plasmid ที่น่าสนใจยิ่งกว่านั้นคือเมื่อรวบรวมข้อมูลจากงานวิจัยก่อนหน้าก็พบว่าจุลินทรีย์สายพันธ์ไหนที่ CRISPR มี spacer ที่ตรงกับปรสิตตัวไหน ..ปรสิตตัวนั้นก็ไม่สามารถจะรุกรานจุลิยทรีย์สายพันธ์นั้นได้ ดังน้ัน Mojica ก็เลยตั้งสมมติฐานใหม่ว่า CRISPR น่าจะทำหน้าที่เป็นระบบภูมิคุ้มกันแบบรับมา** (acquired immunity) ของจุลินทรีย์
แนวคิดเรื่อง acquired immunity ในแบคทีเรียและarcheaถือเป็นอะไรที่แปลกแหวกแนวมาก เพราะสมัยนั้นไม่มีใครคิดว่าเซลล์ชั้นต่ำพวกนี้จะมีระบบภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน ทีมของ Mojica เองก็ยังอธิบายไม่ได้ว่า CRISPR มันทำงานเป็น acquired immunity ได้ยังไง ที่สันนิษฐาน (แบบผิดๆอีกละ) คือมันผลิตRNAมาทำงานต่อต้านการ translation ของไวรัสแบบเดียวกับ RNAi ในสิ่งมีชีวิตชั้นสูง ทีมของ Mojicaพยายามพิสูจน์ด้วยการลองตัดต่อลำดับเบสของ spacer ใน CRISPR ของ E.coli ให้เซลล์สามารถต่อต้านไวรัสใหม่ๆ (ถ้าได้ spacer ที่เหมาะสม) หรือเสียความสามารถต่อต้านไป (ถ้าโดนกำจัด spacer นี้ทิ้ง) อย่างไรก็ตามการทดลองของ Mojica เวิร์กบ้างไม่เวิร์กบ้าง ทำไมไม่รู้ก็เลยไม่ได้ตีพิมพ์ซะที (Mojica เล่าว่าเปเปอร์โดน reject ไปสี่รอบ) สุดท้ายก็ยอมส่งตีพิมพ์โดยเคลมได้แค่ว่า spacer ได้ลำดับเบสมาจากดีเอ็นเอปรสิต ส่วนเรื่องการเป็น acquired immunity เป็นแค่สมมติฐานคาดเดา ในเวลาใกล้ๆกันก็มีอีก 1-2 เปเปอร์รายงานคล้ายๆกันว่า spacer ได้ลำดับเบสมาจากดีเอ็นเอปรสิตแต่ก็ยังไม่สามารถยืนยันได้เต็มๆว่ามันทำหน้าที่เป็น adaptive immunity หรือไม่ อย่างไร
…ผู้ที่พิสูจน์ได้เรื่องนี้ได้จริงๆครั้งแรกเป็นทีมวิจัยของบริษัททำโยเกิร์ต !!
References:
***สำหรับใครที่ไม่คุ้นกับเรื่องภูมิคุ้มกัน: ภูมิคุ้มกันของเรามีหลักๆสองกลุ่มคือ ภูมิคุ้มกันที่มีแต่กำเนิด (innate immunity) และแบบที่รับมาภายหลัง (acquired immunity) โดย innate immunity จะเป็นอะไรที่คงที่ ตายตัว ทุกคนมีเหมือนกัน ขณะที่acquired immunity เกิดขึ้นจากการที่ร่างกายเราได้ลองต่อสู้กับผู้รุกรานก่อนและเรียนรู้ที่จะรับมือกับมันอีกในอนาคต พวกวัคซีนหรือการปลูกฝีก็ทำกันเพื่อกระตุ้น acquired immunity นี้**
- 3
ดูเพิ่มเติมในซีรีส์
โฆษณา
- ดาวน์โหลดแอปพลิเคชัน
- © 2024 Blockdit
