Blockdit Logo (Mobile)
BookDojo
•
20 มี.ค. 2020 เวลา 03:00 • วิทยาศาสตร์ & เทคโนโลยี
CRISPR DIAG วินิจฉัยโควิด เมดอินไทยแลนด์
(ฉบับพยายามให้ง่าย)
ข่าวที่ VISTEC และอีกหลายที่ร่วมกันสร้างชุดตรวจ rapid test สำหรับ COVID-19 ด้วยเทคโนโลยีล้ำสมัยอย่าง CRISPR-Cas13a เป็นเรื่องที่น่ายินดีเป็นอย่างยิ่ง
งานนี้นับเป็นการเปิดตัวของวิทยาศาสตร์บริสุทธิ์ที่คนไทยและรัฐบาลมองว่าไร้ค่ามาเนิ่นนาน และน่าจะเปลี่ยนความคิดของการเรียนวิทยาศาสตร์ว่ามันมีประโยชน์มากนะเฟ้ย อย่างน้อยก็ให้ความรู้วิทยาศาสตร์ติดตัวมาบ้างไม่ให้ถูกใครหลอก อย่างมากก็พัฒนาของเจ๋งๆ อย่าหวังพึ่งคนอื่นอย่างเดียว เราต้องพัฒนาเองด้วย
เข้าเรื่อง CRISPR-Cas13a ดีกว่า
มนุษย์และสัตว์มีระบบภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อนเพื่อต่อกรกับไวรัส แบคทีเรีย ราและพยาธิทั้งหลาย ถ้าภูมิคุ้มกันของเราหยุดฉับพลัน เราคงอยู่รอดได้ไม่ถึงสัปดาห์ แล้วสิ่งมีชีวิตอย่างจุลชีพเล็กจิ๋วอย่างแบคทีเรียนั้นมีระบบภูมิคุ้มกันไหม?
แบคทีเรียมักถูกโจมตีด้วยไวรัสอยู่เสมอ เจ้าพวกตัวนี้มันมีชื่อว่าแบคเทอรีโอฟาจ (Bacteriophage) หน้าตาเจ้าพวกนี้มีหัวและขาเหมือนยานไวกิ้งลงจอดบนดาวอังคาร
wikipedia
เจ้าตัวนี้ทำให้อุตสาหกรรมโยเกิร์ตต้องจอดเพราะถ้าพวกมันบุกมาแบคทีเรียที่ใช้ทำโยเกิร์ตอย่าง Streptococcus thermophilus (ครั้งหน้าลองพลิกอ่านข้างขวดนมเปรี้ยวก่อนดื่ม) ต้องตายไปทำให้นมไม่ถูกหมักกลายเป็นโยเกิร์ต
เจ้าฟาจนั้นเป็นที่ปวดหัวของอุตสาหรกรรมนมและชีสเป็นอย่างมาก และฟาจเองยังถือว่าเป็นสิ่งมีชีวิตที่มีมากที่สุดในโลก มากกว่าแบคทีเรียรวมกันทั้งโลกถึง 10 เท่า!
1
Phage attack! wikipedia
ฟาจมีมากมายหลากหลาย แล้วแบคทีเรียจะหาทางสู้อย่างไร
แบคทีเรียจะมีเอนไซม์ 2 แบบไว้จัดการพวกนี้ แบบแรกอย่าง ECoR1 ที่เป็น Restriction enzyme จะตัดตรงบริเวณที่มีลำดับเบสเป็น palindrome หรืออ่านไปและกลับเหมือนกัน แบบใดแบบหนึ่งเท่านั้นภูมิคุ้มกันแบบนี้เป็น innate immunity ที่เฉพาะกับลำดับเบสแบบเดียวเท่านั้น
แบบที่สองที่เราจะพูดถึงกัน แบคทีเรียได้พัฒนาอาวุธ เป็นเอนไซม์ที่มีชื่อว่า Cas และกระสุนที่ออกแบบมาให้ฆ่าอย่างเฉพาะเจาะจงชื่อว่า CRISPR เมื่ออาวุธปืนบรรจุกระสุนจะเรียกมันว่า CRISPR-Cas
ตัว CRISPR เองก็เป็น palindrome
รูปด้านล่างตัวเหลืองๆคือ Cas ตัว gRNA หรือ guide RNA มาจากชุด CRISPR ในจีโนมแบคทีเรีย ส่วน dsDNA นั้นคือเป้าหมายไวรัสฟาจ ที่เอนไซม์ Cas ตัดอย่างเฉพาะเจาะจง
wikipedia
แบคทีเรียจะเก็บลำดับสารพันธุกรรมของฟาจผู้เป็นศัตรูเอาไว้ในจีโนมของตัวเองเพื่อเอาไว้ใช้ทำกระสุน พอเจอศัตรูลงจอดบนตัวมันแล้วฉีดสารพันธุกรรมเข้ามา พวกมันจะรับมือด้วยปืน Cas ที่บรรจุกระสุนเป็นสารพันธุกรรมที่เข้าคู่ได้กับรหัสพันธุกรรมของไวรัสฟาจ
หลังจากสารพันธุกรรมของฟาจเข้าคู่กับตัว CRISPR-Cas ก็จะตัดให้ขาดเลยฉับ ฉับ ฉับ! ฟาจนั้นก็ไม่สามารถสร้างลูกหลานได้อีกต่อไป!
มนุษย์เห็นสิ่งนี้มาตั้งแต่ปี 1993 โดย Francisco Monica นักวิทยาศาสตร์สเปน เขาเป็นผู้ที่ตั้งสมมติฐานได้อย่างถูกต้องว่าเจ้าเครื่องมือนี้เป็นภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียที่มีต่อฟาจ
ช้าก่อน! เจ้าเครื่องมือนี้เป็นของแบคทีเรียแล้วเราเกี่ยวอะไรด้วย
CRISPR-Cas นั้นมีหลากหลายชนิด แบคทีเรียแต่ละตัวก็มีชุดเครื่องมือที่หลากหลายต่างกันไป มีอยู่ตัวหนึ่งชื่อ CRISPR-Cas9 ที่ถูกค้นพบโดย Alexander Bolotin เมื่อปี 2005 ที่ฝรั่งเศสจากตัว Streptococcus thermophilus ที่ใช้ทำโยเกิร์ต และต่อมาเจอจาก Streptococcus pyogenes ที่ทำให้เกิดเจ็บคอ คออักเสบ
CRISPR-Cas9 เป็นตัวปฏิวัติวงการวิศวกรรมชีวภาพอย่างแท้จริง เมื่อ CRISPR-Cas ได้เข้าคู่กับสารพันธุกรรมที่เป็น dsDNA มันก็จะตัดสายดีเอนเอให้ขาด ถ้าเป็นพวกฟาจ หรือโปรคารีโอต อย่างแบคทีเรีย และอาเคีย พวกมันก็จะตายไป แต่ถ้าเป็นพวกยูคารีโอตอย่างมนุษย์ เมื่อดีเอนเอถูกตัดขาด ในนิวเคลียสของเราจะเกิดการซ่อมแซมตัวเองขึ้น
scientific american
การซ่อมแซมนั้นเกิดในสองแบบ แบบแรกเรียกว่า Homologous recombination เมื่อดีเอนเอถูกตัด มันจะพยายามหา template ที่หน้าตาเหมือนกันมาเพื่อลอกแบบเพื่อให้ดีเอนเอที่ถูกซ่อมแซมนั้นถูกต้อง โดยตัว template นั้นปกติแล้วจะมาจากโครโมโซมที่เป็นคู่กัน หรือเรียกว่า Homologous chromosome (จำได้ไหมว่าโครโมโซมมี 23 คู่ 46 แท่ง) แต่ถ้าเราใส่ template ที่เราอยากได้ลงไปเหมือนแปลนบ้านที่สวมทับกับแปลนเดิมได้พอดี ดีเอนเอที่ถูกซ่อมแซมใหม่ก็จะมีหน้าตาเหมือน template ที่ใส่มา ถ้าแปลนเดิมแก้ไขเล็กน้อยแบบเสริมหน้าต่างอีกบาน ย้ายประตู แปลนใหม่ก็จะมีหน้าตาแบบนั้น ลำดับพันธุกรรมก็จะเหมือนกับ template ที่ใส่เข้าไป เราก็จะได้การตัดต่อยีนตามใจนึก!
อีกวิธีคือถ้าตัดฉับแล้วไม่มี template มาให้ลอกแบบ เซลล์ก็จะพยายามซ่อมของมันเองให้มันต่อกันได้เหมือนเดิม การต่อนี้คิดถึงเวลาเราวาดภาพเหมือนได้ครึ่งหนึ่งแล้วแบบขอกลับบ้าน ภาพที่เหลือก็จะยึกยือไม่เหมือนจริง ดีเอนเอก็จะเกิดการกลายพันธุ์ อาจมีลำดับเบสผิดเพี้ยน (substitution) มีเบสเพิ่มเข้ามา (insertion) หรือเบสหายไป (deletion) ทำให้ยีนนั้นทำงานผิดปกติไป! วิธีนี้เรียกว่า Non-homologous end joining
เราประยุกต์ใช้ CRISPR-Cas9 กับตัดต่อยีน (gene editing) และการทดลองยับยั้งการทำงานของยีน (gene knockout) ได้ตามใจนึกเพียงแค่สังเคราะห์ guide RNA มาประกอบกับ Cas9 เท่านั้นเอง
ตอนแรกเราคิดว่า CRISPR-Cas นั้นตัดได้แค่ดีเอนเอสายคู่ (dsDNA) แต่ต่อมานักวิจัยได้ค้นพบ CRISPR-Cas13a ที่สามารถตัด RNA ได้ด้วย
การค้นพบเริ่มมาจาก ตอนแรกนักวิจัยค้นพบว่า CRISPR-Cas1 นั้นเป็นส่วน conserved ที่มีในทุกชนิด จึงนำลำดับพันธุกรรมมาใช้ค้นหา Cas ตัวใหม่ๆในฐานข้อมูล และก็ได้พบลำดับพันธุกรรมที่ยังไม่ถูกระบุว่าเป็น Cas ชนิดไหน ต่อมาได้ระบุว่าเป็น Cas ตัวใหม่ชื่อว่า CRISPR-Cas13a
1
ตัว CRISPR-Cas13a นั้นมีคุณสมบัติที่แตกต่าง โดยที่มันจะเข้าคู่กับ RNA และเมื่อเอนไซม์ถูกกระตุ้นมันจะเกรี้ยวกราดฟาดงวงฟาดงาไปทำลาย RNA ตัวอื่นๆที่มันเจอจนหมดสิ้น นักวิจัยหัวใสจึงคิดการนำเจ้าตัวนี้ไปใช้งานได้โดยเฉพาะการวินิจฉัยโรค เช่น ไข้เลือดออก อีโบลา มะเร็ง เป็นต้น
ทีมวิจัย Broad institute ได้พัฒนา SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) โดยชื่อพ้องไปกับนักสืบเชอร์ล็อก โฮล์ม
เริ่มจากการสกัด DNA หรือ RNA จากตัวอย่างไม่ว่าจะเป็นน้ำลาย หรือเลือด เปลี่ยน DNA และ RNA ตัวอย่างให้กลายเป็น DNA เสียก่อน แล้วเพิ่มจำนวนโดยการใช้วิธี RPA (สำหรับ DNA) และ rt-RPA (สำหรับ RNA) (recombinase polymerase amplification) เพื่อเพิ่มจำนวนสายดีเอนเอ ข้อดีของวิธีนี้ที่เหนือ PCR คือใช้อุณหภูมิห้อง ไม่ต้องใช้ไฟฟ้า (จริงๆก็ใช้ water bath นะ คิดถึงเครื่องsous vide) เพียงแค่ใส่เอนไซม์และไพรเมอร์ลงไป แล้วใช้ T7 เพื่อแปลงเป็น RNA
CRISPR-Cas13a ที่บรรจุกระสุนเป็นลำดับพันธุกรรมที่เราต้องการหา เช่น โปรตีน s หรือ Orf1ab ของ COVID-19 ถ้าเจอ RNA ที่เข้าคู่ได้ เอนไซม์ก็จะถูกกระตุ้น และฟาดงวงฟาดงา (collateral cleavage)ไปโดน reporter RNA ที่ติดกับโปรตีนเรืองแสงและโปรตีนที่ยับยั้งการเรืองแสง พอถูกตัดขาดฉับ โปรตีนเรืองแสงก็จะสว่างขึ้นมา หรือถ้าไปทำบนแผ่น strip (คิดถึงที่ตรวจครรภ์) จะมี antibody คอยจับโปรตีนไว้ที่แถบแรก ถ้าถูกตัดฉับ โปรตีนจะลอยไปแล้วถูกจับที่แถบสอง แล้วเกิดสีขึ้นมา
ทั้งหมดนี้ไม่ต้องใช้เครื่องมือซับซ้อนอะไรเลย ทุกที่สามารถทำได้เพียงแค่มีสารเคมีและอ่างน้ำร้อน โดยทั้งหมดนี่ใช้เวลาเพียงแค่ 1-2 ชั่วโมงเท่านั้น อย่างไรก็ตามที่เห็นเป็น strip จุ่มนั้นเป็นเพียงขั้นตอนสุดท้าย ขั้นตอนก่อนหน้านั้นมีความซับซ้อนเกินกว่าที่จะซื้อชุดทดสอบจากเซเว่นมาตรวจเองที่บ้านได้ ทั้งการสกัด RNA ไวรัส การแปลเป็น DNA แล้วเพิ่มจำนวน แปลงกลับมาเป็น RNA อีกรอบแล้วถึงนำไปจุ่ม ถ้าอนาคตการตรวจ CRISPR ไม่ต้องสกัดสารพันธุกรรมและเพิ่มจำนวน สามารถจุ่ม Strip ในน้ำลายได้เลย จะมีประโยชน์มากมหาศาล แต่ปัจจุบันการทำแบบนั้นจะลดความไวในการตรวจเชื้อลงหลายสิบเท่า
ปัจจุบันนี้การวินิจฉัยโควิดใช้วิธี realtime RT-PCR เป็นวิธีมาตรฐานที่ตรวจกันทั่วโลก ซึ่งต้องใช้คนที่มีประสบการณ์สูงและเครื่องมือยังซับซ้อนมีราคาแพง จะเห็นได้ว่ามีแค่ไม่กี่โรงพยาบาลในไทยที่สามารถตรวจได้
Roche realtime PCR
ทั้งหมดทั้งมวลเป็นการทดสอบหาตัวไวรัสซึ่งเป็นวิธีทางตรง สามารถค้นหาผู้ติดเชื้อได้ตั้งแต่ก่อนมีอาการ 1-2 วัน จนมีอาการและหลังมีอาการได้อีกนาน ขณะที่ยังมีอีกวิธีที่ถูก ง่าย สะดวก และสามารถพัฒนาเป็นชุดตรวจที่บ้านได้คือการตรวจหาแอนติบอดี (ภูมิคุ้มกัน) ที่จะขึ้นหลังจากติดเชื้อแล้ว 1-2 สัปดาห์
ปัจจุบันมีเจ้าหลักที่มีชุด CRISPR diagnostics อยู่ 2 เจ้าคือ SHERLOCK ที่มีนักวิจัยจาก Broad institute อย่าง Feng Zhang และ Jim Collins และ DETECTR ของ Mammoth ที่ใช้ CRISPR-Cas12a ที่ใช้การตรวจับ DNA จึงลดขั้นตอนยุ่งยากของการเปลี่ยน DNA เป็น RNA โดยใช้ T7 แต่ขั้นตอนเพิ่มจำนวนใช้ LAMP ไม่ได้ใช้ RPA
ไม่รู้ว่าหลักการของไทยจะแตกต่างจากของบริษัทเหล่านี้อย่างไร จาก FB Tao Chayasith Uttamapinant นักวิจัย Synthetic Biology ที่ VISTEC ผู้ที่เริ่มโครงการนี้ ได้ขอ license CRISPR-Cas13a จาก Feng Zhang และได้ร่วมกันทำงานกับจุฬา มหิดล ศิริราช และรพ.พระปกเกล้าอีกด้วย คาดว่าคงได้รับข่าวดีในไม่ช้า (จากงานวิจัยวิธีนี้มันเวิร์คจริงๆ ไม่ยกเมฆ)
ขอบคุณ FB: Biology Beyond Nature: ชีววิทยาเหนือธรรมชาติ ที่ช่วยให้ความรู้ CRISPR อย่างมากมายมหาศาล และ Tao Chayasith Uttamapinant

ดูเพิ่มเติมในซีรีส์

โฆษณา