มหากาพย์ประวัติ CRISPR/Cas ...จากงานวิจัย “ขึ้นหิ้ง” สู่เทคโนโลยีเปลี่ยนโลก
ตอนที่ 3: กองขี้ชี้ทางสว่าง
Escherichia coli (ดูรูปประกอบซ้ายกลาง) เป็นแบคทีเรียเจ้าถิ่นในลำไส้ใหญ่ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมรวมทั้งมนุษย์ ปกตินอกจากการสร้างกลิ่นเหม็นบูดในอุจจาระแล้ว E.coli มักจะไม่ได้ก่อปัญหาอะไรร้ายแรง แถมยังช่วยย่อยกากอาหาร และผลิตวิตามิน K และ B ให้เราอีกด้วย จะมีข้อยกเว้นบ้างก็เฉพาะบางสายพันธุ์ เช่น E.coli O157:H7 ** ซึ่งทำให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษและท้องเสียถ่ายเป็นเลือด
Escherichia coli
ด้วยความที่เป็นแบคทีเรียเลี้ยงง่าย โตเร็ว ไม่อันตราย ทำให้ E.coli เป็นสิ่งมีชีวิตยอดนิยมของบรรดานักชีววิทยา และนักเทคโนโลยีชีวภาพ การศึกษาการค้นพบสำคัญๆในทางชีวโมเลกุล และการพัฒนาเทคนิกต่างๆเพื่อการวิศวกรรมเซลล์ไว้ใช้ในห้องแล็บหรืออุตสาหกรรมมักจะเริ่มทำกันใน E.coli ก่อน แล้วค่อยไปขยายผลต่อยอดในสิ่งมีชีวิตชั้นสูงอื่นๆทีหลัง ยิ่งนักวิจัยนิยมใช้ E.coli เท่าไหร่ก็ยิ่งมีคนสร้างองค์ความรู้+พัฒนาเทคนิกเกี่ยวกับ E.coliมาให้นักวิจัยคนอื่นๆเลือกใช้มากขึ้นเท่านั้น ... E.coli ก็ยิ่งป๊อปปูลาร์ขึ้นไปอีก (เหมือนกับโทรศัพท์มือถือยี่ห้อดังๆที่คนใช้เยอะๆก็จะมีคนสร้างAppนั่นนี่ขึ้นมารองรับเยอะ ... คนก็ยิ่งนิยมใช้ขึ้นไปอีก)
หนึ่งใน E.coli สายพันธุ์ที่ป๊อปปูลาร์ที่สุดคือ E.coli K12 ถูกสกัดแยกมาได้จากอุจจาระของผู้ป่วย (ที่ป่วยด้วยโรคที่ไม่เกี่ยวกับ E.coli) ที่โรงพยาบาลของมหาวิทยาลัย Stanford เมื่อเกือบร้อยปีที่แล้ว (คศ 1922) เชื้อตัวนี้ถูกเพาะเลี้ยง พัฒนา ปรับแต่ง ใช้ประโยชน์ต่างมากมายในวงการชีววิทยา จนถูกกล่าวว่าเป็น “workhorse” (เป็นคำเปรียบเทียบคนหรือเครื่องจักรที่ทำงานหนักต่อเนื่องมายาวนาน) ของวงการชีวโมเลกุลและเซลล์วิทยา
มีคนสังเกตเจอโครงสร้างลำดับเบสซ้ำๆของ CRISPR ใน E.coli ตั้งแต่ปี 1987 แล้ว (สมัยนั้นยังไม่เรียกว่า CRISPR และคนก็ยังไม่ค่อยสนใจศึกษาเท่าไหร่) แต่ก็ล่วงเลยมาถึงปีหลังปี 2000 กว่าจะเริ่มมีการกลับไปศึกษา CRISPR ใน E.coli อย่างลึกซึ้ง หนึ่งในทีมวิจัยที่ทำเรื่องนี้คือทีมของ John van der Oost นักจุลชีววิทยาจากภาควิชาเทคโนโลยีการเกษตรและอาหาร มหาวิทยาลัย Wageningen ประเทศเนเธอร์แลนด์ ก่อนหน้านี้แล็บของ Oost เน้นศึกษาเกี่ยวกับเอนไซม์ เมแทบอลิซึม และการแสดงออกของยีนในแบคทีเรียประเภทต่างๆ ช่วงที่ CRISPR เริ่มเป็นที่สนใจ ทีมของ Oost ก็จับเอา E.coli K12 มาศึกษากลไกการทำงานของ CRISPR ซะละเอียดยิบจนได้ตีพิมพ์ออกมาเป็นเปเปอร์สุดคลาสสิกในวารสาร Science เมื่อปี 2008
John van de Oost
E.coli K12 ที่ทีมของ Oost นำมาศึกษามี CRISPR ที่ประกอบด้วยส่วน spacer (แทนสัญลักษณ์ด้วยสี่เหลี่ยมจัตุรัสสีๆ) ทั้งหมด 12 ชิ้น และใกล้ๆกับ CRISPR ก็มียีน cas อยู่แปดตัวด้วยกันคือ cas3, casA, casB, casC, casD, casE, cas1 และ cas2 (ดูรูปประกอบ) ณ เวลานั้นการศึกษาก่อนหน้านี้เรื่อง CRISPR ในแบคทีเรียตัวอื่นๆทำให้เราพอรู้คร่าวๆแล้วว่า CRISPR และ Cas ทำงานร่วมกันเพื่อเป็นภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียต่อไวรัสหรือดีเอ็นเอแปลกปลอมอื่นๆที่บุกรุกเข้ามาในเซลล์ (ดูตอนที่ 1-2) โดยspacerก็คือชิ้นส่วนของดีเอ็นเอแปลกปลอมที่แบคทีเรียเก็บเอาไว้จากการถูกจู่โจมครั้งก่อนๆเพื่อ “จำ” ว่าผู้บุกรุกหน้าตาเป็นยังไง ดังนั้นดีเอ็นเอแปลกปลอมที่มีลำดับเบสตรงกับspacerก็จะถูกจับได้และไม่สามารถรุกรานแบคทีเรียตัวนี้ได้อีก อย่างไรก็ตามตอนนั้นเราก็ยังไม่รู้ว่าCRISPR/Casมีกลไกการทำงานในระดับโมเลกุลยังไงกันแน่ถึงสามารถป้องกันการรุกรานได้
ระบบ CRISPR/Cas ใน E.coli
ทีมของ Oost เริ่มจากการตั้งคำถามว่าชิ้นส่วนต่างๆที่สังเคราะห์ขึ้นจากระบบ CRISPR/Cas มีปฏิสัมพันธ์ต่อกันอย่างไร ทีมวิจัยพบว่ายีน casA, casB, casC, casD และ casE สามารถสร้าง (ผ่านการ transcribe และ translate) โปรตีนขึ้นมาห้าตัวคือ CasA, CasB, CasC, CasD และ CasE ซึ่งห้าตัวนี้สามารถจับรวมกันเป็นก้อนเดียว ทีมวิจัยตั้งชื่อไอ้เจ้าก้อนนี้ว่า CRISPR-associated complex for antiviral defense หรือเรียกย่อๆว่า “Cascade” ส่วน CRISPR เองสามารถผลิต RNA ออกมาเป็นสายสั้นๆขนาด 57 เบส ซึ่งทีมวิจัยตั้งชื่อมันว่า CRISPR RNA หรือเรียกย่อๆว่า “crRNA” ที่น่าสนใจคือเมื่อทีมวิจัยลองกำจัด (knockout) ยีน casA, casB หรือ casC ทิ้งก็พบ RNA ที่มีขนาดยาวเป็นทวีคูณของความยาว crRNA เช่น RNA ขนาดยาวประมาณ 120 เบส และ 180 เบส ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่ crRNA จะเกิดจากการตัดซอย RNA ที่ยาวกว่าให้สั้นลง และเมื่อทีมวิจัยลองกำจัดยีน casE ก็ไม่พบ crRNA อีกแต่พบ RNA สายยาวๆแทน ดังนั้นสิ่งที่น่าจะเกิดขึ้นคือดีเอ็นเอส่วน CRISPR ถูกผลิต (transcribe) มาเป็น RNA สายยาวๆก่อน (ทีมวิจัยเรียกมันว่า “pre-crRNA”) จากนั้นมันก็ถูกตัดซอยย่อยโดย Cascade กลายเป็น crRNA และในบรรดายีนทั้งห้าตัวที่ประกอบกันเป็น Cascade มี CasE เท่านั้นที่จำเป็น (essential) ต่อการตัด pre-crRNA เป็น crRNA ทีมวิจัยพบว่าเวลาสกัดแยก Cascade จากเซลล์มักจะมี crRNA ติดมาด้วยเสมอ ดังนั้น crRNA แต่ละตัวที่ตัดมาเสร็จแล้วน่าจะเกาะติดกับ Cascade อยู่อย่างนั้นเวลาแยกย้ายไปทำงานต่อ
กลไกระบบ CRISPR/Cas ใน E.coli
เพื่อความชัวร์ ทีมของ Oost ได้ลองสกัดแยกเฉพาะ Cascade และ pre-crRNA มาผสมกันในหลอดทดลอง แล้วก็พบว่า Cascade สามารถตัด pre-crRNA เป็น crRNA ได้จริง นอกจากนี้ยังพบว่า Cascade ไม่สามารถตัด RNA ชนิดอื่นๆ และไม่สามารถตัด pre-crRNA จาก E.coli สายพันธุ์อื่นที่มีลำดับเบสส่วน repeat (แทนสัญลักษณ์ด้วยสี่เหลี่ยมขนมเปียกปูนสีเทาๆ ในรูปCRISPR) ต่างออกไปจาก E.coli K12 ที่ทีม Oost ไปสกัดเอาCascadeมา ดังนั้นCascadeตัด RNA แบบเจาะจงลำดับเบส และลำดับเบสส่วนที่ transcribe มาจาก repeate เป็นตัวบอกว่าต้องตัดที่ไหน นอกจากทีมวิจัยยังพบว่าโปรตีน CasE ที่สกัดมาเพียวๆ (โดยไม่มี Cas ตัวอื่น) ก็สามารถตัด pre-crRNA เป็น crRNA ดังนั้นสรุปได้ว่า CasE ตัวเดียวก็เพียงพอ (sufficient) ที่จะทำหน้าการตัดนี้
ทีมวิจัยลองวิศวกรรม CRISPR สังเคราะห์ขึ้นมาโดยออกแบบให้ส่วน spacer ไปตรงกับลำดับเบสของยีนที่จำเป็นสี่ยีนของไวรัสชนิด Lambda phage ทีมวิจัยพบว่า E.coli ต้องมีทั้ง CRISPR + cascade (casA, casB, casC, casD และ casE) + cas3 จึงจะมีภูมิคุ้มกันต่อไวรัส Lambda และถ้า casE กลายพันธุ์ไปแม้แต่นิดเดียวจนทำให้ไม่สามารถตัด pre-crRNA ภูมิคุ้มกันก็จะใช้การไม่ได้ ดังนั้นการซอย pre-crRNA ย่อยออกมาเป็น crRNA มีความสำคัญต่อการทำงานของภูมิคุ้มกัน ทีมวิจัยพบว่าถ้ากำจัด cas1 และ cas2 ไประบบภูมิคุ้มกันก็ยังทำงานได้เหมือนเดิม ดังนั้นยีนสองตัวนี้น่าจะมีหน้าที่ตรงส่วนอื่น ทีมวิจัยพบว่าถ้า CRISPR มี spacer แค่อันเดียวที่ตรงกับยีนของ Lambda phage ประสิทธิภาพของภูมิคุ้มกันจะลดลงมาก (อัตราการตายของ E.coli ที่ถูกรุกรานโดย Lambda phage สูงขึ้นเทียบกับกรณีที่ spacer ตรงหลายอัน) ดังนั้นหลาย spacer สามารถทำงานประสานกันและส่งเสริมประสิทธิภาพการป้องกันไวรัสให้ดีขึ้น
คำถามน่าสนใจที่ตามมาคือแล้ว Cascade-crRNA ไปทำอะไรกับไวรัสมันถึงไม่สามารถรุกรานแบคทีเรียได้? สมมติฐานที่หลายคนคิดสมัยโน้นคือ CRISPR/cas น่าจะทำงานคล้ายๆกับ RNAi ในเซลล์ยูคาริโอต ซึ่งก็คือเป็น RNA ที่สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนไวรัสด้วยการเข้าไปจับกับ RNA ของไวรัสที่มีลำดับเบสเป็นคู่ตรงข้าม (complementary) กับมัน จากนั้นก็เหนี่ยวนำให้เกิดการย่อยสลาย RNA นั้น RNAi หลายตัวก็ได้วิวัฒนาการให้เปลี่ยนมาทำหน้าที่ควบคุมการแสดงออกของยีนต่างๆในเซลล์อีกด้วย RNAi ถูกค้นพบครั้งแรกในปี 1990 ซึ่งก็ใกล้ๆกับช่วงที่เริ่มมีการศึกษา CRISPR แต่งานวิจัยด้าน RNAi ไปเร็วกว่ามาก ปี 1998 นักวิจัยก็สามารถอธิบายส่วนประกอบและกลไกการทำงานหลักๆของ RNAi ได้เกือบหมดแล้ว ด้วยความเรียบง่ายของหลักการทำงาน RNAi กลายเป็นเทคนิกยอดนิยมสำหรับการกด (knockdown) การแสดงออกของยีนอะไรก็ได้ที่เราต้องการในเซลล์ยูคาริโอตอะไรก็ได้ที่เราสนใจ พอถึงปี2006ทีมวิจัยที่ค้นพบกลไกการทำงานของ RNAi (Andrew Fire จากมหาวิทยาลัย Stanford และ Craig Mello จาก University of Massachusettes) ก็ได้รับรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาและการแพทย์ ความป๊อบปูลาร์ของ RNAi ในช่วงต้นศตวรรษที่ 21 นี้ทำให้นักวิจัยจำนวนไม่น้อยคิดว่า CRISPR/Cas ก็น่าจะทำงานไม่ต่างจากนั้นเท่าไหร่ แถมใครจะไปนึกว่าวงการชีววิทยาจะแจ๊กพ็อตค้นพบอะไรเด็ดๆในเวลาไล่เลี่ยกัน
งานวิจัยของทีม Oost ค้นพบหลักฐานชิ้นสำคัญว่า CRISPR/Cas น่าจะเป็นอะไรที่ต่างออกไป โดยทีมวิจัยได้พบว่าทั้ง spacer ที่ถูกออกแบบให้มีลำดับเบส “เหมือน” กับลำดับเบสของ transcript จากยีนไวรัส และ spacer ที่ถูกออกแบบเป็น “คู่ตรงข้าม” (complementary) ของ transcript จากยีนไวรัส ก็ต่างสามารถยับยั้งการรุกรานของไวรัสได้ทั้งสิ้น ดังนั้นไม่น่าจะเป็นไปได้ที่ crRNA จะต้องไปจับกับ RNA ไวรัสเพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดการสลายตัวอย่างในกรณีของ RNAi ทีมวิจัยก็เลยตั้งสมมติฐานใหม่ว่า crRNA (ร่วมกับโปรตีน Cas อีกหลายตัว) น่าจะมีเป้าหมายที่ดีเอ็นเอของไวรัสมากกว่า ถ้าสมมติฐานนี้จริงก็จะเป็นอีกครั้งที่มีการปฏิวัติมุมมองความสัมพันธ์ระหว่างสามสหายแห่งดินแดนชีวโมเลกุล: DNA, RNA, protein
… Watson & Crick สอนเราตอนปี 1958 ว่า DNA ถอดรหัสมาเป็น RNA ซึ่งจะถูกแปรรหัสต่อเป็น protein (The central dogma of molecular biology ) มุมมองนี้บอกเราว่า RNA ไม่ได้มีบทบาทอะไรนอกจากเป็นแค่ “คนนำสาร” แบบทางเดียวเพื่อส่งต่อข้อมูลพันธุกรรมจาก “นายใหญ่” (DNA) ไปให้ “คนทำงาน” (protein)
… Temin, Dulbecco & Baltimore บอกเราตอนปี 1970 ว่า RNA ก็สามารถย้อนศร ส่งข้อมูลพันธุกรรมย้อนกลับไปดีเอ็นเอได้นะ ด้วยกระบวนการที่เรียกว่า reverse transcription
… Fire & Mello บอกเราตอนปี 1998 ว่าจริงๆ RNA ไม่ได้เป็นแค่คนส่งสารกิ๊กก๊อกนะ แต่มันมีบทบาทสำคัญมากในการควบคุมการแสดงออกของยีน ผ่านระบบที่เราเรียกว่า RNAi
… พอถึงปี 2008 ทีมของ Oost กำลังจะเสนอสมมติฐานว่า RNA กับ protein สามารถจะร่วมมือกันกลับไปรุมยำทำลาย DNA ได้! สมมติฐานนี้ไม่ต้องรอหลักฐานยืนยันนานหรอกครับ เพราะทีมวิจัยอีกทีมกำลังจะตีพิมพ์เรื่องนี้ในอีกไม่กี่เดือนหลังจากนั้น
- 3
ดูเพิ่มเติมในซีรีส์
โฆษณา
- ดาวน์โหลดแอปพลิเคชัน
- © 2024 Blockdit
