ตอนที่ 4: ผู้พิฆาตดีเอ็นเอ
Staphylococcus epidermidis เป็นแบคทีเรียผู้อาศัยบนผิวหนังของเรา ปกติแล้วเจ้าตัวนี้ก็ไม่ได้ก่อปัญหาอะไรยกเว้นแต่ในผู้ป่วยที่ภูมิคุ้มกันอ่อนแอ อีกกรณีนึงที่ S. epidermidis จะก่อเรื่องได้คือเวลาที่มันไปปนเปื้อนอยู่บนเครื่องมือผ่าตัดโดยเฉพาะพวกสายสวน/สายเสียบ (catheter) ต่างๆที่ต้องสอดเข้าสู่ร่างกายโดยเฉพาะในหลอดเลือดทำให้เกิดการอักเสบ เป็นหนอง ฯลฯ S. epidermidis ดื้อด้านต่อการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะเพราะพวกมันสามารถเกาะกลุ่มแน่นบนพื้นผิวพลาสติกเหล่านี้และสร้างเมือกเหนียวๆ มาหุ้มตัวกลายเป็นสิ่งที่เราเรียกว่า biofilm นอกจากนี้ช่วงหลังๆ S. epidermidis และสมาชิกกลุ่ม Staphylococcus อีกหลายตัวที่พบในโรงพยาบาลก็มักจะมียีนต้านยาปฏิชีวนะเพิ่มขึ้นมาอีก ทำให้ยิ่งรักษายากขึ้นไปใหญ่
Staphylococcus epidermidis
พวกจุลินทรีย์โดยเฉพาะแบคทีเรียแทบทุกชนิดมีกลไกประหลาดๆ ในถ่ายทอดพันธุกรรมที่เรียกว่า Horizontal Gene Transfer (HGT) แปลเป็นไทยตรงๆ ว่า “การถ่ายทอดยีนแนวราบ” ปกติการถ่ายทอดพันธุกรรมอย่างที่เราคุ้นเคยกันจัดว่าเป็นแบบ Vertical Gene Transfer (VGT) หรือ “การถ่ายทอดยีนแนวดิ่ง” นั่นคือถ่ายพันธุกรรมจากรุ่นทวด ไล่ลงมาเรื่อยรุ่นปู่ยาตายาย ถึงรุ่นพ่อแม่ รุ่นเรา รุ่นลูก หลานเหลนโหลน ฯลฯ ต่อไป แต่ HGT คือการถ่ายทอดในรุ่นเดียวกันที่ไปมาหาสู่กันโดยอาจจะไม่ได้เป็นญาติกันมาก่อนเลยก็ได้
ถ้าให้เปรียบเทียบให้ฟังขำๆ ก็เหมือนเราไปนั่งป้ายรถเมล์ข้างๆ ฝรั่งนัยน์ตาฟ้า ชาวอัฟริกันปากหนา หรือแม้แต่หมาขนปุย แล้วอยู่ดีๆ “ยีน” ตาฟ้า ปากหนา หรือ ขนปุย ก็ “กระโดด” เข้ามาที่เราเฉยเลย ทำให้เรากลายเป็นคน ตาฟ้า ปากหนา หรือ ขนปุยไปด้วย !! (แถมเรายังส่งยีนพวกนี้ต่อไปให้รุ่นลูกหลานเราได้อีกด้วยกลไก VGT) ปรากฏการณ์แบบนี้ไม่ค่อยเกิดในสิ่งมีชีวิตชั้นสูงที่มีหลายเซลล์แต่พบบ่อยมากในแบคทีเรีย และเป็นสาเหตุสำคัญอย่างนึงที่ทำให้ยีนดื้อยาปฏิชีวนะสามารถแพร่กระจายไปได้เร็ว เพราะยีนพวกนี้สามารถ “กระโดด” ไปมั่วๆ เรื่อยๆ ระหว่างแบคทีเรียที่อยู่ใกล้ๆ กันโดยบางทีอาจจะเป็นคนละสปีชีส์กันเลยด้วยซ้ำ
HGT หรือกลไกการ “กระโดด” ของยีนระหว่างแบคทีเรียมีหลักๆ สามแบบ แบบที่โง่สุดคือการที่แบคทีเรียตัวนึงตาย ทิ้งเศษดีเอ็นเอที่มียีนไว้ แล้วแบคทีเรียอีกตัวที่บังเอิญผ่านมาก็เก็บเอาดีเอ็นเอที่มียีนนั้นไป (ภาษาวิชาการเรียกกลไกนี้ว่า “transformation”)
แบบที่แอดวานซ์ขึ้นมาก็คือการที่ยีนติดไปกับไวรัสกินแบคทีเรีย หรือที่เรียกว่า phage ซึ่งไวรัสพวกนี้บุกเข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย ก็อบปี้ตัวเองมาเยอะๆ แล้วก็แพร่ระบาดออกไปยังแบคทีเรียเซลล์อื่นต่อ ระหว่างกระบวนการนี้บางทีก็มีดีเอ็นเอมียีนจากแบคทีเรียตัวแรกติดไปสู่แบคทีเรียตัวสองด้วย (ภาษาวิชาการเรียกกลไกนี้ว่า “transduction”)
แบบสุดท้ายคือการที่ยีนติดไปกับ conjugative plasmid ซึ่งก็คือชิ้นดีเอ็นเอวงกลมๆเล็กๆ ในเซลล์แบคทีเรีย ชิ้นดีเอ็นเอนี้มีคุณสมบัติพิเศษคือทำให้แบคทีเรียเกิดความ “หื่น” วิ่งเข้าชาร์ตแบคทีเรียตัวอื่นๆที่อยู่ใกล้เคียง จากนั้นก็ทำการ “จูบอย่างดูดดื่ม” เพื่อส่งก็อบปี้และส่งถ่ายแบ่งปัน conjugative plasmid ให้บ้าง (ภาษาวิชาการเรียกกลไกนี้ว่า “conjugation”)
Horizontal gene transfer รูปแบบต่างๆ
ในบรรดา HGT ทั้งสามกลไก การ conjugation มีความสำคัญมากที่สุดในการระบาดของยีนดื้อยา เพราะแบคทีเรียหลายชนิดมีประสิทธิภาพการ transformation ไม่สูงนัก ส่วนการ transduction นั้นไวรัสกินแบคทีเรียส่วนมากเลือกกินแบคทีเรียไม่หลากหลาย ทำให้การถ่ายยีนมักจะอยู่ภายในวงแคบๆ ของแบคทีเรียสายพันธุ์ใกล้ๆกัน ในทางตรงข้าม conjugative plasmid หลายตัวสามารถกระโดดข้ามสปีชีส์แบคทีเรียได้หลากหลายมั่วซั่วไปหมด แถมประสิทธิภาพการถ่ายเทดีเอ็นเอก็สูง ดังนั้นการ conjugation สามารถทำให้ยีนดื้อยากระจายไปในวงกว้าง
ในมุมมองของแบคทีเรียเอง HGT เป็นเรื่องไม่พึงประสงค์เพราะการไปซี้ซั้วรับยีนรับดีเอ็นเออะไรเข้ามาไม่รู้มักจจะก่อผลเสียมากกว่าผลดี (เหมือนกับการรับคนแปลกหน้าเข้าบ้าน) ดีเอ็นเอที่เข้ามาอาจจะเป็นไวรัสที่ทำร้ายเซลล์ หรืออย่างเบาหน่อยอาจจะเข้ามาเป็นแค่ “ตัวถ่วง” ที่ไม่ทำประโยชน์อะไรรังแต่จะทำให้เซลล์สูญเสียทรัพยาการกับการดูแลรักษาและก็อบปีส่งต่อมันไป นานๆ ทีถึงจะฟลุ๊กได้ยีนเจ๋งๆ มาเช่นยีนดื้อยาปฏิชีวนะ อย่างไรก็ตาม แม้แต่เคสยีนดื้อยาเองก็ยังจัดว่าเป็นตัวถ่วงในสภาวะปกติที่แบคทีเรียไม่ได้โดนยาปฏิชีวนะอะไร แบคทีเรียที่มียีนดื้อยามักจจะโตช้ากว่าแบคทีเรียที่ไม่มีเพราะต้องเสียทรัพยากรไปกับยีนและกลไกต้านยาที่ตอนนั้นไม่ได้ใช้ประโยชน์อะไร
ด้วยเหตุนี้แบคทีเรียจึงมีการวิวัฒนาการกลไกต่างๆ เพื่อต่อต้าน HGT เช่นการใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะสำหรับย่อยดีเอ็นเอแปลกปลอม หรือการใช้ CRISPR/Cas อย่างที่เราพูดกันมาแล้วจากตอนก่อนๆ ว่าสามารถทำงานเป็นระบบภูมิคุ้มกันแบคทีเรียจาก phage ดังนั้นก็เลยมีคนคิดว่าถ้าเราเข้าใจและสามารถใช้ประโยชน์จากกลไกต่อต้าน HGT เราก็น่าจะสามารถลดหรือป้องกันการระบาดของยีนดื้อยาได้
Luciano A. Marraffini
Luciano A. Marraffini และ Erik J. Sontheimer จากมหาวิทยาลัย Northwestern สหรัฐอเมริกา พยายามศึกษาว่าระบบ CRISPR/Cas ที่พบในแบคทีเรีย S. epidermidis สามารถป้องกัน HGT ได้อย่างไร งานของทีมวิจัยนี้ตีพิมพ์ในปี 2008 แค่ไม่กี่เดือนหลังจากงานของทีม Oost ที่เราพูดถึงกันตอนที่แล้ว ความสำคัญของงานชิ้นนี้คือเป็นการศึกษากลไกล CRISPR/Cas ในการต่อต้าน HGT แบบ conjugation และ transformation ขณะที่งานก่อนๆ ส่วนใหญ่ (โดยเฉพาะสามตอนที่ผ่านมา) ว่าด้วยการต่อต้านไวรัสซึ่งถือเป็น HGT แบบ transduction ที่สำคัญที่สุดคืองานวิจัยชิ้นนำมาสู่หลักฐานที่ว่า ...
CRISPR/Cas มีเป้าหมายการทำงานเป็นดีเอ็นเอแปลกปลอม ไม่ใช่ RNA (ที่สร้างจากดีเอ็นเอแปลกปลอมอีกที) อย่างที่หลายคนคิดกัน
ระบบ CRISPR/Cas ของ S. epidermidis สายพันธุ์ที่ทีมวิจัยศึกษาประกอบด้วย spacer สามอัน โดย spacer อันแรกซึ่งทีมวิจัยเรียกว่า spc1 (สัญลักษณ์สี่เหลี่ยมสีเหลืองในรูปประกอบ) มีลำดับเบสที่ตรงกับลำดับเบสของยีนสำคัญตัวหนึ่งคือยีน nickase (nes) ที่พบได้ใน conjugative plasmids ทุกชนิดที่พบในแบคทีเรียตระกูล Staphylococcus ทั้งหมดที่เคยมีการศึกษามา
ทีมวิจัยพบว่า S. epidermidis สายพันธุ์ที่มี spc1 จะมีภูมิคุ้มกัน ไม่อนุญาตให้ conjugative plasmids เข้ามาในเซลล์ได้ แต่เมื่อทีมวิจัยลองไปเปลี่ยนลำดับเบสของยีน nes บน conjugative plasmid ให้ต่างออกไปจาก spc1 โดยไม่เปลี่ยนลำดับอะมิโนของโปรตีนที่แสดงออกมาตอนสุดท้าย (ภาษาทางการเรียกว่า “silence mutation”) ก็ปรากฏว่า conjugative plasmid เวอร์ชั่นใหม่นี้สามารถเข้าสู่เซลล์ S. epidermidis ได้ปกติ ผลการทดลองส่วนนี้เป็นการยืนยันสิ่งที่เรารู้แล้ว (จากการศึกษา CRISPR/Cas ในแบคทีเรียตัวอื่นๆที่ผ่านมา) ว่าลำดับเบสของ spacer ต้องตรงกับลำดับเบสของยีนในดีเอ็นเอผู้บุกรุก (ไม่ว่าจะเป็น phage หรือ conjugative plasmid) ระบบ CRISPR/Cas ถึงจะสามารถทำงานได้
คำถามคาใจของบรรดานักวิจัย CRISPR/Cas ตอนนั้นคือ CRISPR/Cas ยับยั้ง phage หรือ conjugative plasmid ในระดับ RNA (เช่น ไปจับ ยับยั้ง และเร่งการสลาย RNA จากยีนของ phage หรือ conjugative plasmid) หรือในระดับ DNA (เช่น ไปจับและตัดทำลาย DNA แบบเอนไซม์ตัดจำเพาะ)
ทีมวิจัยตอบคำถามนี้ด้วยการลองแทรกลำดับเบสพิเศษที่เรียกว่า intron ขนาดยาวสองร้อยกว่าเบสลงในยีน nes กลางๆตำแหน่งที่ลำดับเบสตรงกับ spc1 (ดูรูปประกอบ) ความพิเศษของลำดับเบสใน intron คือพอมันถูกแสดงออกมาเป็นส่วนนึงใน RNA ของยีน nes แล้ว มันสามารถจะ “ตัดตัวเอง” (self-splicing) หลุดออกมาจาก RNA ส่วนที่เหลือได้ ดังนั้นแม้ว่ายีน nes แทรก intron จะมี “ลำดับเบสดีเอ็นเอ” ต่างออกไปจากยีน nes ดั้งเดิม หลังจาก intron ตัดตัวเองออกไปแล้วก็จะเหลือ “ลำดับเบส RNA” ที่เหมือนเดิมเด๊ะๆ ดังนั้นถ้า CRISPR/Cas ทำงานโดยการยับยั้งการแสดงออกของยีนในระดับ RNA ก็ต้องสามารถป้องกันการเข้ามาของ conjugative plasmid ที่มียีน nes แบบแทรก intron ตัวนี้ด้วย .... ปรากฏว่าระบบ CRISPR/Cas ป้องกันการเข้ามาของ conjugative plasmid ตัวนี้ไม่ได้ ดังนั้นระบบ CRISPR/Cas ไม่น่าจะทำงานด้วยการยับยั้ง RNA
เพื่อคอนเฟิร์มสมมติฐานนี้อีกชั้นนึง ทีมวิจัยลองออกแบบพลาสมิด (ดีเอ็นเอวงๆ ขนาดเล็ก) ที่มีลำดับเบสบางส่วนตรงกับ spc1 โดยลำดับเบสส่วนนี้ไม่ได้อยู่ในยีนอะไรทั้งสิ้น และอยู่ในตำแหน่งที่จะไม่ถูกแสดงออกมาเป็น RNA เลยด้วยซ้ำ ทีมวิจัยลองพยายามนำพลาสมิตอันนี้เข้าสู่ S. epidermidis โดยตรงด้วยกระบวนการ transformation ปรากฏว่าไม่สามารถนำเข้าสู่เซลล์ได้ ขณะที่ชุดควบคุมที่ไม่มีส่วนที่ลำดับเบสตรง spc1 สามารถถูก transformation ได้ปกติ ดังนั้นทีมวิจัยสรุปได้ว่า
a) CRISPR/Cas สามารถยับยั้ง transformation ได้ด้วย
b) CRISPR/Cas ไม่น่าจะยับยั้ง RNA เพราะการ transformation คือการที่ดีเอ็นเอเข้าเซลล์ไปเฉยๆไม่ได้เกี่ยวกับการแสดงออกของยีนเหมือนกรณี phage หรือ conjugation
c) CRISPR/Cas ไม่น่าจะยับยั้ง RNA ชัวร์ๆ เลย เพราะว่าตำแหน่งเป้าหมายบนพลาสมิตที่ลำดับเบสตรง spc1 ไม่ได้อยู่ในยีน ไม่ได้ผลิต RNA อะไรออกมาทั้งนั้น
Marraffini และ Sontheimer สรุปว่า CRISPR/Cas เป็นกลไกป้องการตัวของเซลล์จากดีเอ็นเอแปลกปลอม สามารถป้องกันดีเอ็นเอที่เข้ามาได้จากหลายเส้นทางไม่ว่าจะเข้ามาโดยไวรัส (transduction), ผ่านทางแบคทีเรียตัวอื่น (conjugation) หรือจากสิ่งแวดล้อมโดยตรง (transformation) การทำงานของ CRISPR/Cas ต่างจากกลไกป้องกันตัวที่เรารู้จักกันดีอย่าง RNAi โดยสิ้นเชิง เป็นไปได้สูงมากที่ CRISPR/Cas จะเข้าจู่โจมตัดทำลายดีเอ็นเอแปลกปลอมโดยตรง ลำดับเบสของดีเอ็นเอเป้าหมายการตัดทำลายกำหนดโดยลำดับเบสของส่วน spacer (ซึ่งถูกแสดงออกมาในรูปของ crRNA จากงานของ Oost ที่ตีพิมพ์ไม่กี่เดือนก่อนหน้านี้)
… ในเปเปอร์จากปี 2008 นี้ Marraffini และ Sontheimer ทิ้งท้ายไว้ว่าอย่างน่าสนใจว่า
“From a practical standpoint, the ability to direct the specific, addressable destruction of DNA that contains any given 24–48 nucleotide target sequence could have considerable functional utility, especially if the system can function outside of its native bacterial or archaeal context.”
“จากมุมมองของการประยุกต์ใช้ การที่เราสามารถสั่ง (ให้ CRISPR/Cas) ตัดทำลายดีเอ็นเอที่ลำดับเบสอะไรก็ได้เราต้องการที่ขนาดความยาวเป้าหมาย 24-28 เบส (~ความยาวของspacer) จะมีประโยชน์มหาศาล โดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าระบบอันนี้สามารถถูกนำไปใช้ในเซลล์อื่นๆที่ไม่ใช่แบคทีเรีย”
ยุคของ CRISPR/Cas genome editing กำลังจะเริ่มขึ้นแล้ว !!
Reference:
- 2
ดูเพิ่มเติมในซีรีส์
โฆษณา
- ดาวน์โหลดแอปพลิเคชัน
- © 2024 Blockdit
