ตอนที่ 5: กรรไกรตัดดีเอ็นเอนอกสถานที่
สี่ตอนที่ผ่านมาเราได้อ่านเรื่องราวการไขความลับของระบบ CRISPR/Cas จากจุลินทรีย์หลายชนิดโดยนักวิจัยหลายกลุ่ม ถึงช่วงประมาณ 2008 เรารู้แล้วระบบ CRISPR/Cas ทำหน้าที่เป็นภูมิคุ้มกันของเซลล์จุลินทรีย์ดีเอ็นเอแปลกปลอม โดยระบบนี้มีลักษณะพิเศษคือใช้ลำดับเบส RNA (ที่สร้างจาก CRISPR) เป็นตัว “ชี้เป้า” บอกให้เอนไซม์ Cas (ที่สร้างจากยีน cas ซึ่งอยู่ใกล้ๆกับ CRISPR) ไปยับยั้งหรือทำลายดีเอ็นเอเป้าหมาย เรื่องนี้เป็นเรื่องฮือฮาในวงการเพราะว่าที่ผ่านๆ มาเราเคยเห็นแต่:
a) การที่โปรตีน/เอนไซม์ไปจับ ยับยั้ง หรือทำลายดีเอ็นเอด้วยตัวของมันเอง เลือกเป้าหมายเองโดยไม่ต้องมีใครสั่ง เช่น พวกเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) ต่างๆ
b) การใช้ RNA ชี้เป้าเพื่อยับยั้ง/ทำลาย RNA หรือที่เรารู้จักกันในชื่อ RNAi
ในมุมมองของการประยุกต์ใช้ การออกแบบ RNA ทำได้ง่ายกว่าการออกแบบโปรตีนหรือเอนไซม์มาก เพราะ RNA ประกอบจากหน่วยย่อยพื้นฐานแค่สี่แบบ (นิวคลิโอไทด์ A, U, G, C) และเราก็ทำนายได้ไม่ยากว่าหน่วยย่อยๆ ในสาย RNA พวกนี้จะมีปฏิสัมพันธ์กันยังไง พับม้วน RNAเป็นรูปร่างอะไร (เรารู้ว่า A จับ U และ G จับ C)
ในทางตรงข้าม การออกแบบโปรตีนหรือเอนไซม์เป็นเรื่องยาก เพราะมันประกอบจากหน่วยพื้นฐานถึงยี่สิบแบบ (กรดอะมิโนยี่สิบชนิด) แถมปฏิสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อยก็ทำนายยากมาก (กรดอะมิโนแต่ละตัวขนาดต่างกัน ประจุไม่เหมือนกัน ชอบ/ไม่ชอบน้ำไม่เท่ากัน ฯลฯ)
นี่เป็นเหตุผลหลักข้อหนึ่งที่ทำให้เทคโนโลยี RNAi กลายเป็นเทคโนโลยีสุดฮ็อตอย่างรวดเร็วหลังจากกลไกของมันถูกค้นพบ เพราะเราสามารถออกแบบ RNAi ให้ไปจับและยับยั้ง RNA เป้าหมาย “อะไรก็ได้” ในเซลล์ได้ไม่ยาก ในทางกลับกันเทคโนโลยีวิศวกรรมโปรตีนให้ไปจับนั่นทำนี่ในเซลล์ไปได้ช้ากว่ามากเนื่องจากความยากในการออกแบบนั่นเอง
… RNAi ออกแบบง่าย ใช้ง่าย แต่ทำได้แค่จัดการ RNA ด้วยกัน ไม่สามารถเปลี่ยนแปลงยีนหรือจีโนมที่เป็นดีเอ็นเอได้
… Restriction enzyme ลงไปลุยงานระดับยีนหรือจีโนมได้ แต่ว่าออกแบบยาก
แต่ CRISPR/Cas เหมือนจะรวมเอาทั้งจุดเด่นเรื่องความใช้ง่ายอย่าง RNAi และจุดเด่นเรื่องความสามารถในการทำงานระดับดีเอ็นเอของ Restriction enzyme
อย่างไรก็ตามก่อนที่จะมีคนคิดเอา CRISPR/Cas ไปประยุกต์ใช้ในงานปรับแต่งจีโนม (genome editing) เรายังต้องเติมจิ๊กซอว์องค์ความรู้ที่ยังขาดไปอีกอย่างน้อยสองชิ้น
… ชิ้นแรกคือการตอบคำถามที่ว่า CRISPR/Cas “ยับยั้ง” ดีเอ็นเอแปลกปลอมยังไงกันแน่? ยับยั้งด้วยการเข้าไปจับไว้เฉยๆ? ยับยั้งด้วยการสับให้เละเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อย? ยับยั้งด้วยการตัดให้ขาด? ถ้าใช่ ตัดที่ไหน?
… ชิ้นที่สองคือการตอบคำถามที่ว่า เราสามารถโยกย้ายเอาระบบ CRISPR/Cas ที่มีอยู่/ใช้การได้ในจุลินทรีย์ตัวนึง (ตามธรรมชาติ) ออกไปใช้งานในเซลล์แบบอื่นได้ไหม? เซลล์อะไรบ้าง? และขั้นต่ำเราต้องเอาส่วนไหนของระบบ CRISPR/Cas ไปบ้างมันถึงจะใช้การได้?
ผู้ที่ตอบสองคำถามนี้คือทีมวิจัยจาก Danisco บริษัท “นม เนย และโยเกิร์ต” สัญชาติเดนมาร์กเจ้าเก่าที่เราอ่านกันไปในตอนที่สอง ร่วมกับทีมวิจัยจากแคนาดาและลิทัวเนีย ส่วนตัวเอกฝั่งแบคทีเรียของเราก็คือ Streptococcus thermophilus ...แบคทีเรียยอดนิยมในโยเกิร์ตที่เราได้รู้จักมันไปในตอนที่สองเช่นกัน แถมยังเป็นสายพันธุ์เดียวกันเลยด้วย (DGCC7710)
Sylvain Moineau
ทีมวิจัยจาก Danisco ร่วมมือกับทีมวิจัยจากแล็บของศาสตราจารย์ Sylvain Moineau นักจุลชีววิทยาจากแคนาดาผู้เลื่องชื่อด้าน phage (ไวรัสกินแบคทีเรีย) เพื่อศึกษาว่าดีเอ็นเอแปลกปลอมที่เข้าสู่เซลล์ S. thermophilus ถูก CRISPR/Cas จัดการยังไง? เร็วแค่ไหน?
ทีมวิจัยลองส่งพลาสมิด (ดีเอ็นเอที่เป็นวงกลมๆ สามารถแบ่งตัวเพิ่มจำนวนได้) เข้าไปในเซลล์ S. thermophilus ทีมวิจัยพบว่าถ้าพลาสมิดมีลำดับเบสตรงกับเป้าหมายของ CRISPR ที่ S. thermophilus มีอยู่ plasmid ก็จะอยู่ในเซลล์ได้ไม่นานก่อนจะสลายหายไป เมื่อทีมวิจัยพยายามสกัดเอาพลาสมิดที่เพิ่งใส่เข้าเซลล์ไปออกมาดูให้รู้ว่ามันหายไปตอนไหนยังไง ทีมวิจัยก็พบเรื่องประหลาดว่าพลาสมิดที่สกัดกลับออกมามีลักษณะเป็น เส้นตรง (linear) แทนที่จะเป็นวงกลมๆ (circular) อย่างที่มันควรจะเป็น เมื่อศึกษาลึกลงไปก็พบว่าไอ้เส้นตรงๆ ที่เจอมันคือพลาสมิตวงกลมที่โดนตัดให้ขาด และตำแหน่งของการตัดก็อยู่ในบริเวณที่เรียกว่า “protospacer” หรือบริเวณที่มีลำดับเบสตรงกับลำดับเบสของ “spacer” บน CRISPR ทีมวิจัยลองทำการทดลองนี้ซ้ำกับพลาสมิดหลายๆ แบบ และกับดีเอ็นเอของไวรัสผลที่ได้ออกมาตรงกันคือดีเอ็นเอที่ส่งเข้าไปโดยตัดที่ตำแหน่ง protospacer
งานวิจัยชิ้นนี้ถูกตีพิมพ์ในวารสาร Nature เมื่อปี 2010 เป็นครั้งแรกที่เรายืนยันได้ว่าระบบ CRISPR/Cas (จาก S. thermophilus) ทำงานโดยการตัดดีเอ็นเอให้ขาดฉับเดียว แบบจำเพาะเจาะจงลำดับเบส ซึ่งลำดับเบสเป้าหมายในการตัดนั้นก็ถูกกำหนดโดย crRNA ที่สร้างมาจากส่วน spacer ของ CRISPR นั่นเอง ข้อมูลสำคัญอีกชิ้นที่รายงานในเปเปอร์นี้คือการตัดดีเอ็นเอนั้นต้องอาศัยเอนไซม์ที่สร้างมาจากยีนที่ชื่อว่า Cas5
ถ้าจำกันได้จากตอนที่สอง เราได้รู้จักยีน Cas5 กันพอเผินๆ แล้วมีความสำคัญต่อการที่ CRISPR/Cas จะทำงานต่อต้านดีเอ็นเอแปลกปลอม และเราก็ได้รู้จากการศึกษาเปรียบเทียบลำดับอะมิโนของ Cas5 จากฐานข้อมูลเอนไซม์ด้วยว่าเจ้า Cas5 นี้น่าจะเป็น nuclease หรือเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ตัดดีเอ็นเอ ด้วยข้อมูลทั้งหลายทั้งมวลที่มีอยู่ในจุดๆนี้เราก็พอจะปะติดปะต่อเรื่องราวคร่าวๆได้ว่า crRNA จาก CRISPR สั่ง Cas5 ให้ไปตัดดีเอ็นเอแปลกปลอมแบบเจาะจงตำแหน่ง
… คำถามที่ตามมาคือ ตอนนี้เรารู้แล้วว่า Cas5 จำเป็นต่อการตัดดีเอ็นเอ แต่เราต้องการ Cas ตัวอื่นร่วมด้วยอีกรึเปล่า? มีองค์ประกอบอื่นที่จำเป็นอีกมั้ย? หรือว่า Cas5 ฉายเดี่ยวได้ (ภายใต้คำสั่งของ crRNA จาก CRISPR)?
ขอเล่าย้อนให้ฟังนิดนึงว่าจริงๆ แล้ว Cas5 ถูกค้นพบและรายงานตั้งแต่ปี 2005 โดยทีมวิจัยจากฝรั่งเศสนำโดย Alexander Bolotin ช่วงนั้นเริ่มมีทีมวิจัยหลายทีมศึกษาเรื่อง CRISPR/Cas และรายงานเกี่ยวกับการมีอยู่ของยีนในบริเวณใกล้ๆ กับ CRISPR ที่เราเรียกว่า Cas ยีน Cas มีอยู่หลายตัวและแบคทีเรียแต่ละชนิดก็มีชุดของยีน Cas ที่ไม่เหมือนกัน (ลองกลับไปดูรูปประกอบจากตอนที่ 2-4) แม้แต่แบคทีเรียชนิดเดียวกันก็อาจจะมี CRISPR/Cas หลายชุดบนจีโนม (S. thermophilus DGCC7710 เอง มีระบบ CRISPR/Cas อยู่ถึง 4 ชุด) แต่ละชุดก็มียีน Cas ต่างกันอีก
ทีมของ Bolotin พบชุดของยีน Cas ใน S. thermophilus ที่ต่างจากของแบคทีเรียอื่นๆที่ศึกษากันมา โดยมียีน Cas5 เป็นยีนขนาดใหญ่ (หลายพันกิโลเบส) และทำนายจากลำดับอะมิโนแล้วน่าจะเป็น nuclease ด้วย ทีมของ Bolotin “เดา” ถูกด้วยว่า Cas5 น่าจะทำหน้าที่ย่อยดีเอ็นเอและ CRISPR/Cas เป็นอะไรที่ต่างไปจาก RNAi โดยสิ้นเชิง เรื่องสำคัญอีกเรื่องที่ทีม Bolotin ค้นพบก็คือไวรัสหรือพลาสมิดที่ CRISPR/Cas ป้องกันได้ต้องมีส่วนที่เรียกว่า protospacer ซึ่งมีลำดับเบสตรงกับลำดับเบสของของ spacer บน CRISPR เท่านั้นยังไม่พอ ตรงข้างๆ protospacer ต้องมีลำดับเบสพิเศษแถมมาที่เรียกว่า Protospacer Adjacent Sequence หรือที่เรียกย่อๆ ว่า PAM ซึ่งหลังจากนี้เวลาเราพูดถึง “ลำดับเบสเป้าหมาย” ของ CRISPR/Cas ไม่ว่าจะบนพลาสมิดหรือจีโนมไวรัสเราจะต้องมี PAM อยู่ด้วยเสมอ
แนวคิดทีม Bolotin ถือว่าก้าวหน้ามากในสมัยนั้นแต่ไม่ได้มีหลักฐานการทดลองสนับสนุนแน่นหนานอกเหนือจากการอ่านและตีความจากลำดับเบสของแบคทีเรีย พลาสมิด และไวรัสที่มีอยู่แล้วตามธรรมชาติ ดังนั้นทีมที่ได้เครดิตเต็มๆ ในการค้นพบกลไกตัดดีเอ็นเอโดย CRISPR/Cas เลยกลายเป็นทีมจากแล็บของ Moineau และบริษัท Danisco
เนื่องจากมีช่วงหลังๆ มามีหลายทีมวิจัยศึกษาเรื่อง CRISPR/Cas แต่ละทีมก็เลือกโฟกัสกับแบคทีเรียตัวโปรดที่ทีมสนใจ ต่างคนต่างทำงาน ต่างตั้งชื่อยีน Cas ที่ตัวเองเจอกันไปเรื่อยก็เลยเกิดปัญหาชื่อซ้ำซ้อน ต้องมาจัดระบบตั้งชื่อกันใหม่ให้เหมาะสม ยีน Cas5 จาก S. thermophilus ที่ทีม Bolotin, ทีม Moineau และบริษัท Danisco ศึกษากันมาหลายปีก็โดนหางเลขถูกตั้งชื่อใหม่ไปด้วย โดยถูกตั้งชื่อใหม่เป็น “Cas9” !! (ถึงตอนนี้ใครที่ติดตามเรื่องเทคโนโลยี CRISPR/Cas น่าจะร้องอ๋อแล้ว เพราะนี่คือ Cas ชนิดที่ป๊อบปูลาร์ที่สุด ถูกนำไปใช้มากที่สุด)
Virginijus Siksnys
ปี 2011 ทีมวิจัยจาก Danisco (ซึ่งโดนบริษัท Dupont ซื้อไปตอนต้นปี 2011) ร่วมมือกับทีมวิจัยของโปรเฟสเซอร์ Virginijus Siksnys จากประเทศลิทัวเนีย ตีพิมพ์รายงานการนำ CRISPR/Cas ไปใช้ “นอกสถานที่” เป็นครั้งแรก โดยทีมวิจัยได้ลองตัดต่อเอายีน Cas9 (ซึ่งแต่ก่อนเรียกว่า Cas5) และดีเอ็นเอส่วน CRISPR จาก S. thermophilus ไปใส่ไว้บนพลาสมิด จากนั้นก็นำเอาพลาสมิดนี้ไปใส่ในแบคทีเรียชนิด E. coli ผลปรากฏว่า E. coli ที่ได้รับการปลูกถ่ายพลาสมิดนี้ไปมีภูมิคุ้มกันต่อดีเอ็นเอแปลกปลอมที่มีเป้าหมายของ CRISPR อยู่ พูดอีกอย่างก็คือ CRISPR/Cas9 จาก S. thermophilus สามารถทำงานได้ใน E. coli ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่ความแตกต่างทางสรีรวิทยาจาก S. thermophilus อย่างยิ่ง (อยู่คนละไฟลัมกัน แถม E.coli ยังเป็นแกรมลบ ในขณะที่ S. thermophilus เป็นแกรมบวก)
การค้นพบนี้สำคัญตรงที่มันแสดงให้เห็นถึงความเรียบง่ายของระบบ CRISPR/Cas9 ที่ต้องการเอนไซม์แค่ตัวเดียว (Cas9) ในการทำงาน ไม่ใช่ CRIPSR/Cas ทุกชนิดที่จะเรียบง่ายแบบนี้ บางตัวอย่างเช่นระบบของ E. coli ที่เราดูกันไปในตอนที่สามต้องใช้ Cas ถึงห้าตัวทำงานร่วมกัน ในเปเปอร์ฉบับเดียวกันนี้ทีมวิจัยยังได้เริ่มเจาะลึกศึกษาโครงสร้างส่วนประกอบของ Cas9 ว่าส่วนไหนอะมิโนลำดับที่เท่าไหร่จับดีเอ็นเอ และมีบทบาทสำคัญในกระบวนการตัดดีเอ็นเอให้ขาด Cas9 กำลังจะกลายเป็นดาวเด่นของวงการตัดต่อดีเอ็นเอหลังจากนั้นอีกไม่นาน
น่าแปลกที่เปเปอร์จากปี 2011 นี้ทีมวิจัยจากบริษัท Danisco และทีมของ Siksnys ไม่ได้พูดถึงความเป็นไปได้และประโยชน์มหาศาลจากการนำ CRISPR/Cas9 ไปใช้ในการตัดแต่งพันธุกรรมเลย เนื้อหาส่วนการอภิปรายการประยุกต์ใช้พูดถึงแต่ว่า การที่เราสามารถปลูกถ่าย CRISPR/Cas9 ข้ามสายพันธุ์แบคทีเรียได้ จะทำให้เราสามารถพัฒนาสายพันธุ์แบคทีเรียที่ทนต่อไวรัสหรือดีเอ็นเอแปลกปลอมได้ดีขึ้น ไม่รู้ว่าทีมบริษัท Danisco มัวแต่หมกมุ่นคิดเรื่องการพัฒนาสายพันธุ์แบคทีเรีย (ทนไวรัส) สำหรับหมักชีสหมักโยเกิร์ตรึเปล่าเลยลืมเรื่องการประยุกต์ใช้ที่กว้างกว่านั้น? หรือว่าทีมวิจัยมองออกแล้ว แต่กั๊กไอเดียนี้ไว้ก่อนรอให้ทำการทดลองเพิ่มอีกหน่อย?
หนึ่งปีหลังจากนั้น (2012) ทีม Danisco/Siksnys ตีพิมพ์อีกเปเปอร์นึงแสดงหลักฐานว่าเราสามารถ “โปรแกรม” CRISPR/Cas9 ของ S.thermophilus ให้ไปตัดชิ้นดีเอ็นเอที่ลำดับเบสที่เราต้องการ และประกาศว่านี่แหละจะเป็นสุดยอดแห่งเครื่องมือปรับแต่งดีเอ็นเอแห่งอนาคต!! เปเปอร์ฉบับนั้นออกมาในวารสาร PNAS วันที่ 4 กันยายน 2012
… น่าเสียดายที่เปเปอร์นั้นออกมาช้าไป! เพราะไม่ถึงสองเดือนก่อนหน้านั้นอีกทีมวิจัยตีพิมพ์ตัดหน้าไปแล้วในวารสาร Science วันที่ 28 มิถุนายน 2012 ว่าด้วยการใช้ CRISPR/Cas9 ของแบคทีเรียอีกตัวชื่อ Streptococcus pyogenes ในการปรับแต่งดีเอ็นเอ
... ทีมวิจัยนี้นำโดย Jennifer Doudna และ Emmanuelle Charpentier: สองสุภาพสตรีที่กำลังจะกลายเป็นผู้ทรงอิทธิพลแห่งวงการ CRISPR/Cas genome editing และได้รับรางวัลโนเบลจากเทคโนโลยีนี้!
- 3
ดูเพิ่มเติมในซีรีส์
โฆษณา
- ดาวน์โหลดแอปพลิเคชัน
- © 2024 Blockdit
